ООО «Лабораторная Диагностика»
ООО «Лабораторная Диагностика»  
 Главная   Новости   О компании  Каталог продукции и цены   Оформить заказ   Контакты 
 
  
Каталог продукции
  Гематология  
  Гемостаз  
  Иммуногематология  
  Иммуногистохимия
  Иммуноферментный анализ (ИФА)
  Иммунохимия  
  Клеточные технологии  
  Клиническая биохимия
  Коагулометрия  
  Микробиология  
  Мультиплексный анализ  
  Оборудование для биохимии и
  молекулярной биологии
  Общелабораторное оборудование
  Онкология  
  Пищевая промышленность  
  Программное обеспечение  
  Проточная цитометрия
  ПЦР-лаборатория
  Рекомбинантные белки
  Репродуктивные технологии
  Сортировка клеток
  Спектрофотометрия  
  Стволовые клетки (Stem Cells)
  Трансплантология
  Цитогенетическая диагностика
  Экспресс-лаборатория  

 
/ Обзоры и публикации

ИММУНОЦИТОХИМИЯ СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

Антитела для иммунохимии производства Santa Cruz

Santa Cruz Biotechnology является одним из крупнейших производителей мирового рынка антител. Santa Cruz также предлагает siРНК, клеточные лизаты, экстракты тканей и вспомогательные реагенты для иммуногистохимии.

1. Введение

Идея локализации антигенов в тканях с помощью антител впервые была реализована в начале 40-х гг. Впоследствии иммуноцитохимические методы стали широко применяться в молекулярной клинической диагностике, а с середины 70-х гг., после открытия моноклональных антител, их роль еще более возросла.

Иммуноцитохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые компоненты (антигены), основываясь на их связывании с антителами. Место связывания определяют при помощи меченых антител или методом вторичного мечения. Использование такого подхода для выявления патологии на клеточном уровне позволяет детально исследовать функции и химический состав клеток и сопоставлять полученные результаты с известными морфологическими данными, что дает возможность глубже проникнуть в суть патологического процесса.

Использование антител лежит в основе исследований самых разных молекулярных образований: структурных компонентов клетки, клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов), рецепторов на клеточной поверхности и т. д. Большинство антител связываются с компонентами и продуктами нормальных клеток, но некоторые специфичны в отношении антигенов, характерных для раковых клеток. Такие антитела использовались в качестве маркеров при исследовании процессов дифференцировки и трансформации клеток злокачественных новообразований. Однако наивно полагать, что с помощью антител можно прямо идентифицировать раковые клетки, скорее антитела лишь указывают на изменения картины генной экспрессии.

2. Выбор иммуноцитохимического метода


Из всего многообразия иммуноцитохимических методов (ИЦХ), играющих важную роль в молекулярной клинической диагностике, нужно выбрать один, наиболее приемлемый для данной лаборатории. При этом выборе возникают следующие вопросы; как готовить, фиксировать и обрабатывать препараты тканей? Какие антитела и какую систему иммунодетекции использовать? Такое разнообразие методов дает большие преимущества при проведении научных исследований, но их использование в диагностических целях сопряжено с рядом ограничений, и выбор оказывается не таким уж большим. Выбирая тот или иной иммуноцитохимический метод для рутинной диагностики, учитывают следующие факторы.

а.  Чувствительность.

Чувствительный метод позволяет выявлять даже небольшие количества антигена при минимальном  фоновом окрашивании. Это зависит от авидности, аффинности и титра первых антител, а также от чувствительности метода детекции. Конечно, для точной диагностики лучше пользоваться высокочувствительными методами, но при выборе приходится учитывать их стоимость и быстроту.

б.  Достоверность и воспроизводимость результатов.

При рутинном тестировании гораздо важнее воспроизводимость результатов, чем чувствительность метода. Так, простой метод, который состоит из небольшого числа процедур и

использует обычные реактивы, дает меньше ошибок.

в.   Стоимость.

С учетом стоимости реактивов и оборудования, а также времени, затрачиваемого на тестирование, иммуноцитохимические анализы могут быть довольно дорогими. Снизить их стоимость без ухудшения результатов может тщательный предварительный отбор.

г.   Универсальность.

Метод должен быть пригоден для анализа всех типов тканей и их препаратов.

д.   Возможность автоматизации и окрашивания партий препаратов.

е.   Безопасность.

Выбор метода может зависеть и от личных предпочтений исследователя.



3. Изготовление препаратов


Как правило, в диагностических лабораториях для анализа используют кусочки ткани, фиксированные формалином, залитые в парафин и нарезанные с помощью стеклянного ножа. Эта схема применяется десятки лет и была разработана исходя из того, что гистопатологи используют для диагностики исключительно морфологические критерии. Для иммуноцитохимиков, которых интересуют биологические характеристики препарата, она может оказаться неприемлемой. Главная проблема состоит в том, что при заливке в парафин и последующем изготовлении срезов могут разрушиться как раз те компоненты ткани, которые хотят исследовать. Так, возможна полная или частичная утрата этих компонентов, их химические изменения, маскирование антигена. Совершенство системы иммуномечения или уникальность первых антител не имеют

значения, если антиген утрачен или не доступен для антитела.

Следовательно, важно помнить, что круг антигенов, которые можно выявить на парафиновых срезах, уже, чем на замороженных. Поэтому решение вопроса о том, фиксировать или замораживать препарат, зависит от выявляемых антигенов.


3.1. Тканевые срезы

3.1.1. Изготовление препаратов


Процедурафиксации или замораживания препаратов для ИЦХ должна быть очень быстрой, чтобы максимально сохранить антигенные компоненты и морфологию ткани и не допустить лизиса клеток, приводящего к потере и диффузии антигенов.

Большинство хирургических биоптатов, если они хранятся нефиксированными в течение 24 ч при температуре 4 С, остаются интактными. Очень маленькие биоптаты, которые исследуют в нефиксированном виде, необходимо предохранять от высыхания. Их транспортируют, завернув в смоченную солевым раствором марлю или поместив в специальную среду. ИЦХ-методами можно исследовать также образцы ткани, полученные при аутопсии, при этом чем быстрее начат анализ, тем лучше результаты. Ряд антигенов, например некоторые онкогенные белки или факторы роста, сохраняют целостность только при немедленном замораживании препарата.


3.1.2. Качество срезов


При любом способе приготовления срезы должны быть ровными, достаточно тонкими, однородными по толщине; помещать их нужно на чистые предметные стекла. Надорванные или «жатые» срезы должны быть отбракованы, поскольку все эти неоднородности затрудняют интерпретацию результатов.


3.1.3. Прикрепление срезов к предметным стеклам


Серьезной проблемой является потеря тканевых срезов во время окрашивания. Вероятность потерь высококачественных и достаточно сухих срезов меньше, но при работе с некоторыми тканями и длительных исследованиях она остается весьма высокой. В таких случаях можно покрывать стекла специальными адгезивами, не влияющими на последующие процедуры.

Обычно при работе со срезами, приготовленными методом замораживания—высушивания, и с парафиновыми срезами, которые легко отделяются от подложки, мы покрываем стекла желатиной с алюмохромовыми квасцами. Плохо прилипают к стеклу ткани, подвергнутые кислотной декальцификации или недостаточно хорошо обработанные. Методика покрытия стекол желатиной с алюмохромовыми квасцами описана в протоколе 2.1. Если срезы предварительно обрабатывают протеолитическими ферментами, то желатинового покрытия может оказаться недостаточно для прочного прилипания срезов. В таких случаях можно использовать более сильные адгезивы, например поли-L-лизин [1] или органосилан ([2]; см. также гл. 4).


Протокол 2.1.

Покрытие предметных стекол желатиной с алюмохромовыми квасцами

1. Растворяют 2,5 г желатины в 500 мл дистиллированной воды, нагревая раствор до 50 °С при постоянном помешивании.

2. После растворения желатины добавляют 0,25 г алюмохромовых квасцов и хорошо перемешивают раствор.

3. Охлаждают раствор до комнатной температуры и хранят его при 4 °С.

4. Перед использованием нагревают раствор до 60 °С и фильтруют в химический стакан.

5. Погружают в раствор чистые предметные стекла, не касаясь их поверхностей. Вынимают стекла, помещают их на подставку и сушат в термостате при 60 °С не менее 1 ч. После охлаждения стекла можно хранить в коробках при комнатной температуре.


3.1.4. Криостатные срезы

Криостатные срезы лучше других подходят для выявления широкого спектра антигенов, однако при этом необходимо, чтобы образцы тканей были получены и хранились соответствующим образом, а в ходе фиксации и приготовления срезов не нарушилась морфология ткани и сохранились антигены. Процедура приготовления криостатных срезов описана в протоколе 2.2.


а. Замораживание и хранение образцов

Идеальными для получения криостатных срезов являются образцы ткани размером не более 10 х 10 х 5 мм, маркированные и быстро замороженные в жидком азоте. Иногда для ускорения замораживания применяют изопентан, охлажденный в жидком азоте. Большинство лабораторий пренебрегают этим приемом, однако если есть опасность физической деформации ткани

(например, мышечной), такая процедура может оказаться весьма полезной. Замороженные образцы следует хранить в жидком азоте или в морозильнике при -70 °С, а во время приготовления срезов температура не должна превышать -20 °С. Необходимо иметь в виду, что при длительном хранении образцов ткани при низкой температуре происходит их усыхание.

На наш взгляд, замороженные ткани лучше всего держать в плотно закрытых пластиковых флаконах. Кусочек ткани помещают во флакон таким образом, чтобы его не пришлось размораживать перед приготовлением срезов, и заливают средой, обеспечивающей оптимальные условия разрезания при данной температуре (optimal cutting temperature, ОСТ, Miles Scientific, UK). Затем флакон маркируют, быстро замораживают и оставляют на хранение. Этот способ позволяет избежать отбора неоправданно больших образцов тканей и свести к минимуму их усыхание. По мере необходимости образцы вынимают из морозильника и сразу же помещают в криостат для приготовления срезов. Когда температура повысится до -20 °С, кусочек ткани вместе с заливочной средой вынимают из флакона и закрепляют в держателе с соответствующей ОСТ. Чтобы не возникало проблем с выниманием ткани, лучше не пользоваться круглодонными флаконами с резьбой; оптимальными являются полиэтиленовые флаконы объемом 2,5 мл фирмы Kartell, UK. После приготовления срезов оставшийся кусочек ткани вновь помещают во флакон, заливают ОСТ и хранят в жидком азоте.


б. Приготовление срезов

Чаще всего работают со срезами толщиной 4-6 мкм. Приготовленные срезы помещают на стекло и высушивают на воздухе при комнатной температуре не менее 30 мин, а при температуре 4 °С — до 24 ч. Если срезы не окрашены, то стекла заворачивают в алюминиевую фольгу попарно, срезами наружу, и помещают в холодильник. При —20 °С срезы можно хранить месяцы и даже годы. Когда понадобится проводить иммуноцитохимический анализ, стекла вынимают из холодильника, не разворачивая фольгу до тех пор, пока стекла не прогреются до комнатной температуры. Это позволяет избежать скапливания на стеклах конденсата, заметно изменяющего морфологию ткани.Подобным способом с небольшими модификациями можно готовить замороженные срезы любых тканей. Иногда уменьшают время высушивания, чтобы сохранить особенно неустойчивые антигены.Определенные трудности возникают при приготовлении срезов трепанобиоптатов костного мозга, которые применяют при исследовании лейкозов и других гематологических нарушений. Если костный мозг гиперклеточный, то образцы можно обрабатывать точно так же, как другие ткани, и резать обычным стальным ножом. Твердую костную ткань — если она присутствует в образце в большом количестве -лучше удалить, поскольку она не представляет интереса для анализа.

Спикулы, пронизывающие костный мозг, обычно хорошо режутся, хотя и при более низкой температуре,. Чтобы срезы получались более качественными, кусочек ткани следует ориентировать под прямым углом к режущей кромке ножа. Это особенно важно, когда для получения срезов хорошего качества требуется прочное их прилипание к стеклу и когда срезы делают острым лезвием бритвы. Использование агентов, удаляющих из тканей кальций, необязательно и может только ухудшить их антигенные свойства и морфологию. Разработанный метод удаления кальция [3] требует продолжительного времени и не очень удобен для диагностических исследований. Если не удается получить удовлетворительные срезы, то лучше использовать для ИЦХ-анализа «столбики» трепанобиоптатов. Их готовят, как любые другие цитологические препараты (разд. 3.2), но, конечно, до замораживания трепанобиоптата.Когда нужны более толстые замороженные срезы, можно использовать свободно плавающие срезы, сделанные на замораживающем микротоме. Окрашивание таких срезов улучшает их проницаемость для антител, но при этом может понадобиться дополнительная обработка срезов, например детергентами.

Не следует делать замороженные срезы, если имеются хоть какие-то подозрения на присутствие в ткани инфекционных агентов. Таких агентов можно выявить окрашиванием фиксированных и заключенных в парафин тканей, и если они обнаружены, то необходимо провести дезинфекцию или вообще отказаться от приготовления срезов. При исследовании тканей больных, инфицированных ВИЧ или другими вирусами, образцы обрабатывают бета-проприолактоном [4], который инактивирует вирусы, не влияя на антигенные свойства ткани.


в. Фиксация

Как показывает наш опыт, наилучшим фиксатором замороженных срезов является абсолютный ацетон; фиксацию проводят при комнатной температуре или при 4 "С. Срезы погружают в ацетон на 10 мин, а затем высушивают на воздухе. Антитела или блокирующие вещества наносят непосредственно на сухой срез.Для лучшего сохранения морфологии ткани и некоторых антигенов разработано несколько альтернативных способов с использованием смеси периодата натрия, лизина и параформальдегида [5,6]. Ценность такой обработки состоит в том, что при этом можно транспортировать ткани до их фиксации [5].


Протокол 2.2.


Приготовление замороженных срезов для иммуноцитохимического анализа

1.Делают криостатные срезы быстрозамороженных кусочков тканей толщиной 5 мкм и высушивают их на воздухе. Если в течение суток срезы не будут окрашены, заворачивают предметные стекла в фольгу, надписывают и хранят при —20 °С. По мере надобности вынимают стекла из холодильника, разворачивая фольгу только после того, как стекла прогреются до комнатной температуры.

2. Указывают на стеклах названия антител, используемых для мечения.

3. В течение 10 мин фиксируют срезы на стеклах в ацетоне при комнатной температуре.

4. Высушивают стекла на воздухе. Антитела наносят прямо на сухой срез.


3.1.5. Парафиновые срезы


Как мы уже говорили, тканевые антигены могут утрачиваться на каждом этапе приготовления парафиновых срезов. И все же с помощью рутинных гистологических методов удается выявить достаточно большое число антигенов, что позволяет решать многие важные диагностические проблемы. Чтобы добиться лучшего окрашивания препаратов, следует иметь в виду несколько моментов.


а. Фиксация

Наиболее удобными гистологическими фиксаторами, позволяющими сохранить морфологию ткани, являются растворы на основе формалина. К сожалению, они отрицательно влияют на сохранность антигенов, особенно при длительной фиксации, но пока какой-либо замены формалину при проведении рутинных гистологических исследований не найдено. Если есть возможность получать свежие образцы ткани, то лучше использовать фиксаторы, наиболее подходящие для ИЦХ, например периодат-лизин-параформальдегид (ПЛП) и ПЛП-бихромат [7, 8].

Однако это предполагает, что специалист по молекулярной диагностике заранее знает, какие именно исследования ему предстоит проводить, а это бывает нечасто.Полагают, что одни антигены формалин разрушает полностью, число других при таком способе фиксации снижается незначительно, третьи маскируются. Один из способов расширения круга антигенов, поддающихся выявлению в фиксированных формалином и заключенных в парафин тканях, состоит в применении более чувствительного метода детекции, позволяющего обнаруживать даже незначительные количества антигенов, Другой подход заключается в обработке срезов протеолитическими ферментами до их иммуноокрашивания. Прежде чем рассматривать этот метод, стоит вкратце остановиться на механизме фиксации тканей формалином. В его основе лежит образование метиленовых мостиков между аминогруппами белков. Такое поперечное сшивание может маскировать те участки молекул, которые должны были бы связаться с антителами; именно для разрушения сшивок срезы и обрабатывают ферментами.


Обработка протеолитическими ферментами.

Для этой цели используют несколько ферментов. Среди них:



•   Трипсин

• Протеаза

•   Пепсин

• ПротеиназаК

•   Проназа[9]

• Фицин[10]





Выбор фермента зависит от:

•   времени фиксации;

•   характера фиксирующего агента;

•   выявляемого антигена.


Ферментативная обработка необходима не всегда. Она неприемлема, если нужно выявить антигены, разрушающиеся при протеолизе. В любом случае ее следует проводить с осторожностью, поскольку слишком длительная инкубация срезов с ферментом ухудшает качество окрашивания и изменяет морфологию ткани. Кроме того, для лучшей повторяемости результатов необходимо помнить следующее:

•  нужно использовать свежеприготовленные растворы, а фермент добавлять в предварительно прогретый раствор;

•  прежде чем наносить на предметные стекла раствор с ферментом, их необходимо прогреть до нужной температуры;

•  для прогрева растворов и их хранения лучше использовать водяную баню, а не термостат.


Протокол 2.3.

Обработка протеолитическими ферментами парафиновых срезов тканей, фиксированных формалином


Материалы

•  Раствор трипсина: 0,1% (в/о) трипсин типа II (ICN Biochemicals 150213) в 0,1% СаСI2, рН 7,8 (рН доводят с помощью 0,1% NaOH или 2% НСI). Прежде чем добавлять трипсин, прогревают раствор СаСI2 до 37 °С не менее 15 мин в водяной бане. Трипсин хранят при 4 °С

•  Раствор протеазы; 0,0125% (в/о) бактериальная протеаза типа -XXIV (Sigma P-8038) в буфере 50 мМ трис-НС1, 100 мМ NaCl, рН 7,6 (ТСБ) при 37 °С. Протеазу хранят в сухом виде при температуре ниже 0 °С. Прежде чем добавлять ее, буфер прогревают не менее 15 мин в водяной бане

•Раствор пепсина: 0,4% (в/о) пепсин (Sigma Р-7012) в 0,01 М НС1, рН 2,0


Методика

1. Готовят по обычной методике гистологические срезы толщиной 4-5 мкм. Высушивают их при

37 °С в течение ночи или при 60 °С в течение 1 ч. Надписывают стекла, указывая наносимые на срезы антитела.

2. Удаляют парафин со срезов в трех сменах ксилола, по 2 мин в каждой смене.

3. Проводят срезы через батарею спиртов, 100%, 100%, 70%, по 2 мин в каждом.

4. Тщательно промывают срезы водопроводной водой, а затем споласкивают в дистиллированной воде.

5. Прогревают срезы в дистиллированной воде при 37 °С в течение 5—10 мин.

6. Стряхивают со стекол воду и помещают их в раствор трипсина, протеазы или пепсина,

7. Останавливают ферментативную обработку, опустив стекла со срезами в дистиллированную воду, а затем в ТСБ. Антитела и блокирующий раствор следует наносить на влажные, а не на сухие срезы.


Продолжительность протеолитической обработки зависит от перечисленных выше факторов. Кроме того, иногда нужно учитывать и длительность фиксации ткани. Поэтому для каждого из антител необходимо проводить пробные обработки, с тем, чтобы подобрать оптимальные условия протеолиза в тканях, приготовленных обычным способом. Если условия приготовления отличались от стандартных, требуются дополнительные предварительные исследования.

При фиксации тканей отличными от формалина фиксирующими агентами протеолиз может оказаться необязательным благодаря другому механизму фиксации. Более того, обработка ферментами может быть даже противопоказана. Так, при фиксации агентом Карнуа фермент полностью изменяет морфологию ткани. Поэтому при проведении молекулярно-диагностических тестов следует помечать кусочки тканей, не фиксированных формалином, особенно если предполагается провести ИЦХ-анализ.


б. Выбор блока ткани

Лучше всего окрашиваются свежефиксированные, маленькие или среднего размера кусочки (блоки) ткани. Кроме того, для их окраски требуется меньше реактивов. Когда имеется большой блок ткани, но предполагается исследовать лишь его часть или если ткань гомогенна, следует разрезать блок на несколько кусочков, удобных для работы.


в. Высушивание срезов

При высокой температуре или длительном нагревании антигены могут денатурировать. Обычно для высушивания при 37 °С достаточно 8—24 ч. Если требуется провести срочный анализ, можно прогреть срезы при 60 °С в течение 15—60 мин. При выявлении особенно нестабильных антигенов высушивание лучше проводить при комнатной температуре.


г. Депарафинирование

Как и при всех способах окрашивания, очень важно полностью удалить со срезов парафин и соответствующие растворители. Если на срезах останутся следы парафина, то не все антитела смогут проникнуть в ткань и срез окрасится неравномерно.

Парафин удаляют в трех сменах ксилола, по 2 мин в каждом. Если используются растворители на основе эфирных масел цитрусовых, .то стекла выдерживают в них дольше. Перед тем как промыть срезы водой, их следует провести через три смены спиртов (100%, 100%, 70%), по 2 мин в каждой.


д. Хранение блоков тканей

Блоки, залитые в парафин, хорошо хранятся при комнатной температуре. На устойчивых к формалину антигенах такое хранение не сказывается или сказывается очень незначительно. Можно привести примеры целого ряда успешных исследований блоков ткани, зафиксированных 30 лет назад [13, 14] или хранящихся даже более 150 лет.


е. Декальцификация

Приготовление качественных срезов осложняется наличием в тканях, особенно в костной, солей кальция, которые желательно удалить после фиксации. Для этого имеется широкий выбор реактивов, различающихся по своей способности влиять на сохранность антигенов. Как правило, большинство антигенов сохраняется в присутствии хелатирующих веществ. Приемлема и непродолжительная обработка некоторыми кислотами [15, 16].


3.1.6. Альтернативные методы получения срезов

Разработан ряд методов получения срезов, позволяющих сохранить гистологические свойства тканей в такой же степени, как в фиксированном формалином материале, и их антигенный состав -как в криостатных срезах. Помимо методов, в которых используются альтернативные фиксаторы, представляет интерес метод лиофилизации.

а. Срезы, полученные из лиофилизованных блоков Ткани замораживают, лиофилизуют и заключают в парафин. Срезы таких блоков можно готовить так же, как срезы любого парафинового блока. Поскольку фиксация и обработка растворителями не проводится, в залитой в парафин ткани сохраняется значительно больше антигенов и не изменяется морфология [17].

При резке таких парафиновых блоков требуется особая осторожность, поскольку ткани становятся хрупкими. Готовые срезы плавают в ванночке с водой (но не со спиртом) при температуре 25—28 °С. Срезы можно осторожно расправить на прогретом столике, а затем подсушить при температуре 37 °С.Залитые в парафин блоки ткани можно хранить при комнатной температуре, однако в случае длительного хранения лучше держать их при температуре от —20 до 4 °С. Аналогично, если срезы не будут использованы сразу после высушивания, их хранят при —20 "С точно так же, как замороженные срезы.


б. Срезы, заключенные в смолу

Долгое время считалось, что для проведения ИЦХ нельзя использовать срезы тканей, заключенных в гликольметакрилат (ГМА). Однако оказалось, что при соответствующих модификациях этого метода в тканях сохраняется достаточно много антигенов. Результаты получаются лучше, если образцы обрабатывают при низкой температуре. Имеют значение также типы используемых фиксатора, смолы, катализаторов и пластификаторов [9, 18—21 ]. В связи с небольшой толщиной получающихся срезов лучше применять высокочувствительные методы детекции, а также обрабатывать срезы протеолитическими ферментами.


3.2. Мазки

Иммуноцитохимические методы — полезное подспорье для идентификации клеток крови и тканевых жидкостей, а также для исследования препаратов, полученных при хонкоигольной аспи-рационной биопсии (ТАБ).


3.2.1. Изготовление препаратов

Препараты для ИЦХ могут быть трех типов: а) отпечатки; б) мазки, полученные подходящими цитологическими или гематологическими методами; в) препаратв1, полученные центрифугированием клеточных суспензий. Последний метод предпочтителен, когда в распоряжении исследователя имеются биологические жидкости с небольшим количеством клеток, жидкости, полученные методом ТАБ или содержащие много белка, который нужно отмыть перед иммуноокрашиванием. Основные этапы приготовления препаратов для ИЦХ описаны в протоколах 2.4 и 2.5.


Протокол 2.4.

Центрифугирование материала, полученного методом ТАБ*)

1. Собирают материал, полученный при тонкоигольной аспирационной биопсии, в среду RPMI (Gibco, UK).

2. Центрифугируют при 600 g в течение 5 мин.

З.Удаляют супернатант и ре суспендируют осадок в 3 мл этой среды**).

4. С помощью лабораторной центрифуги (например, cytospine machine фирмы Shandon, UK) при скорости 550 об./мин наносят суспензию на предметные стекла (из 3 мкл суспензии получают 12 препаратов, по 250 мкл на препарат).

5. Высушивают стекла и, если не требуется срочного окрашивания, хранят их при —20 °С завернутыми в алюминиевую фольгу.

*)Аналогичные процедуры, за исключением п. 1, можно использовать при работе с другими цитологическими жидкостями.

**) Если в образце содержится много сывороточных белков, желательно промыть клетки еще раз, т. е. повторить шт. 2 и 3.

Когда концентрация клеток в образцах велика и особенно когда образуются агрегаты, затрудняющие приготовление мазков, заключают клеточный препарат в агар, фиксируют формалином, проводят через парафин и готовят срезы, как с случае парафиновых блоков. Иногда (аспираты костного мозга или препараты ТАБ) формируют из клеток «шарик», заключают его в

ОСТ, замораживают и готовят криостатные срезы.Заметим, что препараты из некротизированных тканей и препараты с большим содержанием эритроцитов или со следами мокроты, как правило, малопригодны для проведения иммуноцитохимического анализа.


3.2.2. Фиксация

Для исследования клеточных мазков с помощью ИЦХ используют следующие фиксаторы:



•  Ацетон

• Эфир/спирт

•  Метанол

• Ацетон/фосфатно-солевой буфер (ФСБ)

•  Этанол

• Ацетон /Ф С Б/формалин

•   Формалин

• Ацетон/цитратный буфер





Тип реактива и продолжительность обработки зависят от природы исследуемых антигенов. Наш опыт показывает, что лучше остановиться на несложном универсальном методе с одинаковым режимом обработки всех цитологических препаратов. Мы фиксируем препараты в смеси ацетон : метанол (1:1, о/о) в течение 90 с или - для лучшего сохранения морфологии — в смеси ацетон : метанол : формалин (19 : 19 : 2, о/о). После фиксации предметные стекла промываем в двух сменах триса или ФСБ не менее 5 мин.

Не следует фиксировать влажные препараты, поскольку продолжительное воздействие спиртовых растворов может повлиять на антигенные свойства тканей.


Протокол 2.5.

Изготовление цитологических препаратов для иммуноцитохимии

1. Высушенные на воздухе мазки или препараты, полученные центрифугированием клеточных суспензий, обрабатывают рутинным способом. Если их не предполагается окрасить в течение суток, стекла заворачивают в фольгу, надписывают и хранят при —20 °С. По мере надобности вынимают стекла из холодильника, не разворачивая фольги, пока они не прогреются до комнатной температуры.

2. Помечают на стеклах, какие антитела используются. С помощью алмазного маркера, стеклографа или специального иммуноцитохимического карандаша (Dako) обводят препарат в кружок.

3. Фиксируют препараты в смеси ацетон : метанол (50 : 50) при комнатной температуре в течение 2 мин.

4. Промывают стекла в ТСБ, рН 7,6, в течение 2 мин. Перед нанесением на препарат антител или блокирующей сыворотки удаляют излишки буфера.


4. Первые антитела

В распоряжении исследователей имеется богатый выбор антител к антигенам тканей человека. Многие из них уже давно используются для диагностики, другие лишь недавно охарактеризованы и только вводятся в практику. Заинтересованный читатель найдет многочисленные примеры их использования в работах [22, 23].

Выбор антител для целей диагностики зависит от того, какую именно патологию предполагается выявить. Другой важный критерий — стоимость. Необходимо также учитывать специфичность и титр антитела, его сродство (аффинность) к антигену-мишени.

4.1. Проверка антител

Если вы только приступаете к работе с данным антителом, необходимо:

а)   определить специфичность антитела; для этого полезно использовать блоки замороженных или заключенных в парафин тканей [24-26];

б)  определить подходящую рабочую концентрацию (разведение) для используемой системы иммуномечения;

в)  выбрать режим фиксации и обработки ткани, включая про-теолиз; лучше использовать фиксаторы, наиболее употребительные в данной лаборатории.


4.2. Хранение антител и работа с ними


К антителам, имеющимся в продаже, прилагается инструкция, в которой указаны условия их хранения, оптимальные для поддержания активности. Не обязательно хранить все антитела при 4 °С, некоторые из них лучше держать при —20 °С, разлив препарат после предварительного анализа свойств антител в подходящие емкости. С одной стороны, хранение при 4 °С может отрицательно сказаться на целостности антител, а с другой — повторное замораживание и оттаивание препарата приводит к еще более быстрому их разрушению.


5. Системы иммуномечения


Разрабатывая и совершенствуя системы иммунномечения, преследуют две цели: а) повышение чувствительности методов визуализации сайтов связывания антител с антигенами; б) создание более универсальных методов. Для этого можно использовать более легко обнаруживаемые метки или применять методику связывания с каждым антигеном большего количества метки.


5.1. Выбор системы иммуномечения


Наиболее простая процедура состоит в непосредственной конъюгации метки с антителом (или антителами) к данному антигену и нанесении конъюгата на срез в один прием прямым методом.




Рис. 2.1. Прямой и непрямой методы иммуномечения.






Этот метод довольно прост, но не очень чувствителен; кроме того, при работе с данной антисывороткой можно использовать только один метод. Известен и другой, более совершенный непрямой метод. В этом случае тканевые срезы инкубируют с немечеными первыми антителами, а затем — со вторыми, мечеными антителами к видам — донорам первой антисыворотки. Такой метод позволяет использовать одно меченое антитело с большим числом первых антител при условии, что последние происходят от одного вида. Поскольку с первым антителом связывается целый ряд антител из второй антисыворотки, чувствительность метода возрастает. Чувствительность можно также повысить, используя третий компонент, меченое антитело к виду — донору второй антисыворотки. Это так называемый трехэтапный, или усиленный непрямой метод (рис. 2.1).

Разработаны и другие системы иммунномечения. Одни из них используются довольно часто, другие — только в исследовательских целях, но представляют несомненный интерес для молекулярной клинической диагностики.


5.1.1. Пероксидазэ—антиперокеидаза (ПАП) и

щелочная фосфатаза—антищелочная фосфатаза (ЩФАЩФ)

В этих двух методах используется растворимый иммуноферментный комплекс, который образуется благодаря сродству меченого фермента к «своему» антителу.



Рис. 2.2. Мечение с использованием пероксидазы—антипероксидазы и щелочной фосфатазы—антищелочной фосфатазы.



Чтобы второе антитело (так называемое антитело-мостик) могло обеспечить связывание первого антитела с антителом комплекса, необходимо, чтобы последнее происходило от того же донора, что и первое. Антитела-мостики должны присутствовать в избытке, чтобы после их связывания с первыми антителами их второй Fab-участок оставался свободным для связывания с антителами комплекса (рис. 2.2).

Оба эти метода обладают такой же чувствительностью, как любой трехэтапный метод; их чувствительность можно повысить, вновь нанося второй и третий слои. Продолжительность этих инкубации может быть меньшей, чем для первых стадий, а наслаивание антител можно проводить столько раз, сколько нужно для оптимального окрашивания. Пользуясь методом ЩФАЩФ, мы обычно проводим два цикла окрашивания, а для антигенов, присутствующих в ткани в малых количествах, — три или четыре цикла.


5.1.2. Авидин-биотиновые и стрептавидин-биотиновые системы

В основе этих методов лежит сродство авидина и стрептавидина к небольшому белку биотину, четыре молекулы которого связываются с одной авидиновой (или стрептавидиновой) молекулой. Обычно эти системы применяются в ИЦХ одним из двух способов: на последнем этапе используется либо меченый авидин, либо комплекс между меченым биотином и авидином.

В обоих случаях необходимы антител а-мостики к видам, от которых получены первые антитела, способные ковалентно связываться с биотином (рис. 2.3). Оба метода достаточно чувствительны и обычно в них используются меченые ферменты. Стрептавидиновый метод имеет то преимущество перед авидиновым, что изоэлектрическая точка стрептавидина близка к нейтральной, а, следовательно, неспецифическое связывание стрептавидина с заряженными группами в тканях практически отсутствует.




Рис. 2.3 Авидин-биотиновые системы





Поскольку стрептавидин- это белок, а не гликопротеин, он не связывается с тканевыми лектинами. Что касается авидина, то он связывается не только с эндогенными ферментами, но и с эндогенным биотином, что создает особенно серьезные проблемы при работе со срезами печени и почек, в первую очередь с замороженными, но не заключенными в парафин тканями. Такое связывание блокируют 20-минутной инкубацией срезов в 0,1% авидине и последующей 20-минутной инкубацией в 0,01% биотине [27]. Имеются сообщения и о неспецифическом связывании авидина с поверхностными антигенами гепатоцитов, инфицированных вирусом гепатита В [28].


5.2. Выбор метки

Метка необходима для визуализации места связывания антигена с антителом. В молекулярной клинической диагностике используется целый ряд меток; все они имеют как преимущества, так и недостатки (табл. 2.1). Три из них широко используются уже несколько лет, а четвертая стала применяться лишь недавно.


Таблица 2.1. Метки, использующиеся в иммуноцитохимии



Тип метки

Преимущества

Недостатки

Примеры

Флуоресцентный краситель

Светочувствительность  Быстрота определения

Необходим специальный микроскоп    «Нестабильные препараты

Трудно провести  корреляцию с морфологией ткани

Флуоресцеинизо-тиоционат

«Родамин Фикоэритрин Техасский красный Диэтиламинокумарин (ДАМК)

Ферменты

Стабильные препараты

Не нужен специальный  микроскоп

Универсальность

Наличие эндогенных ферментов

Пероксидазахрена Щелочная фосфатаза Глюкозооксидаза

-Галактозидаза

Цитохромоксидаза

Металлы

Высокая чувствительность

Дорогие реактивы   Проблемы с усилением серебром

Коллоидное золото

Металлопротеины

Используются в основном в электронной микроскопии


Используются в основном  в научных исследованиях

Ферритин

Радиоизотопы


5.2.1. Флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ)

Флуоресцентные красители не нашли широкого применения в молекулярной клинической диагностике в основном из-за невозможности приготовления стабильных препаратов, необходимости использования флуоресцентного микроскопа и проблем с установлением корреляции между наблюдаемой картиной и морфологией. Однако благодаря своей чувствительности и простоте ФИТЦ-метод часто используют как в прямых, так и в непрямых системах детекции иммуноглобулинов, в частности при диагностировании буллезных поражений или гломерулонефропатий.


5.2.2. Пероксидаза хрена

При имуномечении широко используются конъюгаты антител и других реагентов с пероксидазой хрена (ПХ). Сам по себе этот фермент невидим, но его легко визуализировать с помощью простых гистохимических процедур, в которых используются Н2О2 в качестве субстрата и следующие колориметрические реактивы:

•   3,3'-диаминобензидин

•  З-амино-9-этилкарбазол

•  4-хлор-1-нафтол

•  n-фенилендиаминпирокатехол

•  тетраметилбензидин

•  гомованиловая кислота

•  нафтолпиронин

В присутствии диаминобензидина (ДАБ) образуется не растворимый в органических растворителях продукт. Это позволяет заключать препараты в синтетические среды и стабилизировать их, чем и объясняется популярность данного хромогена. Цвет конечного продукта реакции с ДАБ можно усилить или изменить с помощью различных солей тяжелых металлов. Такой способ повышает чувствительность метода и применяется при двойном мечении.

Усиливающие реактивы можно либо добавлять в раствор ДАБ, либо дополнительно обрабатывать ими препараты после инкубации с ДАБ [29—31]. Мы получали хорошие результаты, добавляя к раствору ДАБ/Н2О2 хлорид никеля (NiCI2*6Н2О) в концентрации 1 мг/мл.

Одна из проблем, возникающих при работе с ПХ, конъюгированной с антителами, состоит в том, что при этом визуализируется и эндогенный фермент тканей, например ПХ, содержащаяся в эритроцитах, полиморфноядерных лимфоцитах и макрофагах.

В большинстве случаев эндогенный фермент удается удалить, предварительно обработав препараты следующими реактивами:

• 3% пероксидом водорода в дистиллированной воде в течение 5-10 мин или 0,3-0,6% метанолом

в течение 10-30 мин;

•  подкисленным спиртом;

•  0,01% фенилгидразином в течение 30 мин;

•  азидом натрия;

•  цианидом натрия;

•  феррицианидом калия;

•  1 % нитроферрицианидом в метаноле;

•  пикриновой кислотой.


Если необходима срочная окраска препаратов, то после проте-олиза и перед окрашиванием с помощью иммунной метки мы обрабатываем препараты 3% Н202в течение 5 мин. Если позволяет время и окрашивается целая партия препаратов, то используется 30-минутная обработка 0,6% Н2О2 в 80% метаноле. В обоих случаях для удаления из срезов следов эндогенной пероксидазы их можно повторно обработать блокирующими растворами.Такие растворы могут неблагоприятно влиять на тканевые антигены, особенно в замороженных срезах и мазках. Чтобы избежать этого, уменьшают время инкубации с Н2О2 или обрабатывают препараты пероксидом после инкубации их с первым антителом. Однако, как показывает наш опыт, ни один из этих способов не обеспечивает полной сохранности морфологии тканей. Часто эндогенный фермент обнаруживается в виде темно-коричневых гранул и его легко отличать от светло-коричневых пятен пероксидазы в системе имунномечения, однако это не решает проблемы, когда исследуемые клетки содержат слишком много эндогенного фермента.

Можно попытаться использовать в качестве субстрата n-фенилендиаминпирокатехол (ФДП), поскольку он выявляет только ферменты растительного происхождения, в том числе перокси-дазу хрена. Однако широкое использование этого реактива в качестве альтернативы ДАБ ограничивается нестабильностью его растворов.

Другой подход состоит в выявлении эндогенного фермента с помощью одного субстрата, а иммуномеченой пероксидазы — с помощью реактива другого цвета. Для рутинных измерений эта процедура слишком сложна, поэтому при большом содержании эндогенного фермента и невозможности его устранения лучше использовать альтернативное мечение.

Возможно, в будущем для пероксидазы будут использоваться и другие субстраты — либо в качестве альтернативы ДАБ, либо для двойного мечения. Несколько методов выявления ПХ приведены в протоколе 2.6.


Протокол 2.6.

Выявление пероксидазы хрена


Метод 1.

Диаминобензидин (ДАБ)*

1. Промывают срезы в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.

2. Растворяют 25 мг 3,3-диаминобензидинтетрахлорида (ДАБ) в 50 мл ТСБ, рН 7,6. Непосредственно перед использованием этого раствора добавляют к нему 160 мкл 3% пероксида водорода (10 объемов), хорошо перемешивают и либо погружают предметные стекла в сосуд с раствором, либо отфильтровывают раствор на стекла, лежащие в инкубационном лотке **).

3. Инкубируют препараты 3—5 мин при комнатной температуре.

4. Тщательно промывают стекла в проточной воде.

5. Окрашивают препараты гематоксилином, дифференцируют и промывают в проточной воде по Скотту до получения синей окраски.

6. Высушивают препараты и заключают срезы в иммерсионную среду DPX (Depex). Пероксидаза выявляется в виде гранул коричневого цвета.


Метод 2.

З-амино-9-этилкарбазол (АЭК)

1. Промывают срезы в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.

2. Готовят два раствора для инкубации препаратов:



а)   З-амино-9-этиленкарбазол

10 мг

Диметилформамид

2,5 мл

б)  Н2О2 (10 объемов)

0,2 мл

0,2 М ацетатный буфер, рН 5,0

50 мл





Смешивают эти два раствора и фильтруют на срезы. Инкубируют препараты до 20 мин при комнатной температуре.

3. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

4. Слегка контрастируют водным раствором гематоксилина (например, фирмы Mayer), дифференцируют до получения синей окраски, но не в подкисленном спирте, поскольку он растворяет АЭК.

5. Пероксидаза выявляется под водной иммерсией в виде гранул кирпично-красного цвета.


Метод 3.

4-хлор-1-нафтол

1. Промывают срезы в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.

2. Готовят раствор для инкубации препаратов:

а)  растворяют 30 мг 4-хлор-1-нафтола в 0,25 мл абсолютного этанола;

б)  добавляют 100 мл 0,05 М ТСБ, рН 7,6, к которому добавлено 50 мкл 30% Н2О2, и хорошо перемешивают;

в)  перед использованием этот раствор фильтруют.

3. Инкубируют препараты до 20 мин при комнатной температуре (контролируя окрашивание под микроскопом).

4. Тщательно промывают препараты в дистиллированной воде.

5. При необходимости контрастируют препараты. Пероксидаза выявляется под водной иммерсией в виде гранул темно-синего цвета.


*ДАБ получают от BDH (продукт под кодовым номером 13033). NB! Есть данные, что ДАБ обладает канцерогенными свойствами, поэтому при работе с ним нужно соблюдать меры предосторожности, например, надевать маску и резиновые перчатки.

**) Если окрашивание производится в сосуде Коплина или специальной емкости, то в одной смене раствора можно инкубировать две партии препаратов, а затем заменять раствор.


5.2.3. Щелочная фосфатаза (ЩФ)


Несмотря на то, что щелочная фосфатаза используется в иммуноцитохимии не так широко, как пероксидаза хрена, она занимает в иммуноцитохимических тестах важное место. На практике необязательно блокировать эндогенный фермент до инкубации препаратов с антисывороткой. Это можно сделать, добавив левамизол в концентрации 1—5 мМ прямо в среду, в которой растворен субстрат, поскольку кишечный фермент теленка, используемый в системе иммунодетекции, устойчив к действию левамизола. Однако в некоторых тканях, например в тканях пищеварительного тракта и плаценты, полностью блокировать активность эндогенного фермента бывает трудно. Когда не нужно проводить предварительную инкубацию, те антигены, которые могут разрушаться в процессе блокирования пероксидазы в замороженных срезах и мазках, легко обнаруживаются. Следует отметить, что растворы субстрата при работе со щелочной фосфатазой более сложные, чем в случае ДАБ, а окрашенные срезы нужно заключать в водную среду. Прекрасные и хорошо воспроизводимые результаты получаются с двумя растворами субстрата, приготовление которыхописано в протоколе 2.7. Раствор с новым фуксином/нафтол-AS-BI-фосфатом дает достаточно стабильную окраску, позволяющую заключать препараты в синтетическую среду, хотя при длительном хранении возможно их выцветание.


Протокол 2.7.


Субстраты для выявления ЩФ


Метод 1

1. Растворяют в стеклянной пробирке 2 мг нафтол-АБ-МХ-фос-фата (N-4875, Sigma) в 0,2 мл диметилформамида (ДМФ).

2. Добавляют к этому раствору 9,8 мл 0,1 М триса, рН 8,2.

3.Добавляют 10 мкл 1 М левамизола (L-9756, Sigma).

4. Непосредственно перед употреблением добавляют 10 мг быстрого красного TR™ (F-1500, Sigma), тщательно перемешивают и отфильтровывают на препараты*).

*)Для метода двойного мечения удобна синяя окраска препарата, поэтому заменяют быстрый красный TR на быстрый синий ВВ.


Метод 2

1. Готовят два раствора:

а)  в стеклянную пробирку с 0,5 мл свежеприготовленного 4% (в/о) нитрита натрия добавляют 0,2 мл 5% нового фуксина (CI 42520, R. Lamb) в 2М НС1, встряхивают 1 мин;

б)  в другой пробирке растворяют 50 мг нафтол-AS-ВI-фосфата (N-2250, Sigma) в 0,6 мл ДМФ.

2. К 100 мл 0,05М трис-HCl, рН 8,4—8,7, добавляют реактивы в такой последовательности:

•  100 мкл Ш левамизола

•  содержимое пробирки (а)

•  содержимое пробирки (б)

3. Тщательно перемешивают и отфильтровывают прямо на препараты.

Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100
© ООО «Лабораторная Диагностика»,  info@LD.ru
телефоны: +7 (495) 461-67-60, +7 (499) 348-25-72, факс: +7 (495) 461-67-63