 |
| ||||||
| |||||||
| / Обзоры и публикации | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Диагностика и лечение инвазивных микозов
Распространенность инвазивных микозовПо данным EORTC/MSGERC 2019 года около 4-5% аутопсий несут в себе признаки инвазивных грибковых заболеваний или инвазивных микозов (ИМ). В наибольшей зоне риска находятся онкологические пациенты и пациенты, принимающие иммуносупрессивные препараты. Распространенность ИМ среди пациентов с острым лейкозом и миелодиспластическим синдромом превышает общую распространенность ИМ почти в 6 раз и составляет 21,7%. Обнаружение инвазивного грибкового заболевания на ранних стадиях дает возможность оперативно скорректировать лечение и предотвратить гибель пациента. В связи с этим возникает необходимость своевременной диагностики инвазивных микозов. Наиболее распространенными выявленными инвазивными инфекциями являются те, которые вызываются видами Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis. Почти 70% всех инвазивных грибковых инфекций в мире вызваны инвазивным кандидозом (ИК), за которым следуют криптококкоз (20%) и аспергиллез (10%). По исследованиям смертность пациентов с кандидозом находится в пределах 25%, тогда как смертность больных инвазивным аспергиллезом от 40% до 90%, по данным статей Санкт-Петербургского ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И. И. Мечникова удалось достигнуть смертности около 30%. Диагностика инвазивных микозовТрадиционно золотым стандартом определения ИМ является посев и культуральные тесты, однако проблемы, связанные с этими тестами, многочисленны. К ним относятся относительно низкая чувствительность, медленное время обработки (от 5 дней до 4 недель для кандидоза), трудоемкий процесс и инвазивный характер образцов, необходимых для тестирования. При этом некоторые виды Candida (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis и C. haemulonii) не поддаются культивированию на обычных грибковых средах. На данный момент можно разделить диагностику ИМ на несколько типов методов. Серологические методы, в основном основаны на обнаружении (1,3)-β-D-глюкана (BDG), полисахаридного компонента клеточной стенки грибка, Rjnjhsq Ghbcencndetn у Candida spp., Pneumocystis jivoveci, Aspergillus spp., Acremonium spp., Fusarium spp. (исключение составляют Cryptococcus spp., Mucrorales и дрожжевая фаза Blastomyces dematitidis). Единственным одобренным FDA методом BDG является анализ сыворотки крови с использованием Fungitell. Было показано, что он полезен для диагностики внутрибрюшного кандидоза и случаев пневмофильной пневмонии с отрицательным посевом крови. Его чувствительность варьируется в пределах 65-75%, а специфичность 70-80%. Анализ BDG проводится в колориметрическом формате и включен в определение EORTC-MSG для грибковой инфекции. Анализ основан на модификации ферментативной реакции LAL –реактива (лизата амебоцитов Limulus) с бактериальными эндотоксинами. Реагент Fungitell® модифицирован таким образом, чтобы исключить реактивность бактериального эндотоксина и реагировать только на (1→3)-β-D глюкан посредством опосредованного фактором G пути. Был так же сделан тест Fungitell STAT, сделанный специально для тестирования 1 пациента, который показывал себя лучше Fungitell в некоторых тестах. Несколько более поздних тестов имеют соизмеримые параметры чувствительности и специфичности. Wako - glucan test (GT) используется для анализа плазмы крови и несколько превышает по чувствительности Fungitell, но проигрывает по специфичности при анализе на кандидоз, что предположительно связано с понижением порогового значения. В клинических условиях GT сравним с Fungitell. В наборе Goldstream используется реагенты limulus. Он также сопоставим с Fungitell и GT, при чем по разным исследованиям имеет разные характеристики. FungiXpert® (CLIA) использует технологию хемилюминесцентного иммуноанализа с автоматическим обнаружением и сокращением времени обнаружения до 50 мин, однако требуется дополнительное тестирование для его одобрения. Однако использование BDG в качестве маркера имеет свои недостатки, так как он неспецифичен, с низкими значениями чувствительности и высокими ложноположительными результатами из-за перекрестной реактивности в случаях заражения бактериями, приеме пациентом иммуноглобулинов или использованием гемодиализа. Это происходит, так как антигены некоторых штаммов бактерий могут вступать в реакцию с тестом и приводить к ложноположительному результату. В исследовании 2010 года показано, что ложноположительные результаты были вызваны бактериями Enterococcus spp., Pseudomonas spp. и Klebsiella sp. По данным статьи применение некоторых антибиотиков, как например цефепим, могут способствовать увеличению количества ложноположительных результатов. Использование при гемодиализе модифицированных целлюлозных мембран также может способствовать появлению ложноположительных результатов, так какцеллюлозосодержащие материалы непосредственно содержат в себе (1-3)-β-D-Глюкан. Диморфные штаммы грибов, например Blastomyces dermatitidis, затрудняют диагностику ИМ имеющимися наборами из-за низкого содержания BDG в клеточной стенке. В связи с этим были разработаны тесты на галактоманнан (ГМ), который является компонентом клеточной стенки вида Aspergillus и специфичен для этого вида грибов. ГМ является основным антигеном, выявляемым в случаях ИА, и может быть легко обнаружен в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), спинномозговой жидкости (ликвор) и крови. В настоящее время существует только один одобренный FDA метод выявления ГМ на основе иммуноферментного анализа PLATELIA Aspergillus (EIA); (Bio-Rad, Франция) в сыворотке крови пациентов и образцах бронхоальвеолярного лаважа (BAL). На основе разработанного моноклонального антитела JF5 (которое связывается с белковым эпитопом, присутствующим на внеклеточном гликопротеиновом антигене, секретируемом конститутивно во время активного роста A. Fumigatus) был разработан тест на галактоманнопротеин (GP). Однако тест на GP оказался аналогичен тесту на GM с точки зрения чувствительности и специфичности. Улучшением стал выпуск теста IMMY GM-EIA (Immuno-Mycologics, Norman, OK), который предполагает использование двух моноклональных антител, одно из которых связывается с таким же GM-эпитопом, а другое - с новой мишенью. IMMY GM-EIA оказался сопоставимым с PLATELIA Aspergillus, для анализа крови. Для более быстрого экспресс анализа используются платформы, основанные на иммунохроматографическом методе. Первым был CrAg-LFA (Immuno-Mycologics; Norman, OK) является единственным, одобренным FDA. - это POC-тест с использованием зонда с моноклональными антителами, который может обнаруживать капсульный антиген в четырех серотипах (A, B, C и D) патогенного комплекса видов Cryptococcus neoformans и комплекса видов C. gattii. Основным преимуществом этого теста является его способность выявлять чрезвычайно низкие уровни циркулирующего CrAg в продромальной фазе (примерно за 22 дня до появления симптомов). Dynamiker Cryptococcal Antigen LFA, (Dynamiker, Китай) был представлен в 2014 году (Tianjin Co., Ltd.). Это многослойный иммунохроматографический анализ для обнаружения капсульных полисахаридных антигенов комплекса видов Cryptococcus (Cryptococcus neoformans и Cryptococcus gattii) в сыворотке крови человека и спинномозговой жидкости (ликвор). LFA Dynamiker CrAg имеет чувствительность 98% в сыворотке крови, 100% в плазме, 100% в ликворе у пациентов с симптомами и 96% в сыворотке крови у пациентов с бессимптомностью по сравнению с LFA IMMY CrAg Специфичность, однако, составила всего 66% в сыворотке крови пациентов с симптомами, 61% в плазме крови бессимптомных пациентов, 91% в ликворе пациентов с симптомами и 86% в сыворотке крови бессимптомных пациентов. Тест Dynamiker выявил значительный уровень ложноположительных результатов. Таким образом Dynamiker имеет чувствительность сравнимую с чувствительностью LFA IMMY CrAg, однако сравнительно меньшую специфичность. Исследователи отметили практические преимущества Dynamiker в лабораторной практике, так как данный тест не требует разбавления образца и лучше защищен от посторонних загрязнений. Еще один тест FungiXpert LFA (ERA Biology, Китай) также является методом быстрого скрининга для эффективной и практичной диагностики и лечения криптококкоза. Другим основным патогеном, вызывающим опасную для жизни грибковую инфекцию у пациентов с ослабленным иммунитетом, является Pneumocystis jirovecii (P. сarinii). Этот штамм гриба, является одной из наиболее часто встречающихся ВИЧ-ассоциированных оппортунистических инфекций. Золотой стандарт основан на микроскопическом обнаружении гриба (хотя он обладает низкой чувствительностью), так как гриб сложен в культивировании. Существует иммунохроматографический анализ на основе антитела mAb476, конъюгированного с 40 нм наночастицами золота, высушенных на полиэфирной ленте, образцом в котором является моча. Метод неинвазивный, однако анализ действительно показывает перекрестную реактивность к Histoplasma capsulatum, и необходимо провести дополнительные исследования, чтобы лучше понять этот параметр. Молекулярные методы представляют собой метод обнаружения с меньшим количеством вариаций и высокой производительностью, дающий более быстрые результаты, чем культуральные тесты. Более того, они являются предпочтительным выбором для выявления устойчивости к противогрибковым препаратам, а также для обнаружения некультивируемых видов. Был разработан метод T2Candida (T2 Biosystems, США), который был одобрен FD, который позволяет выявить C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei и C. Glabrata (на долю которых приходится более 95% случаев кандидоза) в цельной крови за 5 часов при помощи ПЦР в сочетании с магнитным резонансом, но для его реализации нужен специальный прибор T2Dx (T2Biosystems, США). Амплифицированный продукт ДНК Candida детектируют с помощью агломерации суперпарамагнитных наночастиц, несущих зонды, комплементарные мишени, кластеризация наночастиц вызывает изменения во времени релаксации T2, которое детектируется с помощью магнитного резонанса T2 (T2MR). Предел обнаружения составляет всего 1-3 КОЕ / мл цельной крови по сравнению со 100-1000 КОЕ / мл, которые обычно требуются для традиционных методов, основанных на ПЦР. Общая чувствительность и специфичность T2 Candida составляет 91,1% и 99,4% соответственно. Кроме того, T2MR не только охватывает пять видов Candida, но и способен быстро обнаруживать шесть распространенных бактерий (так называемые патогены “ESKAPE”, включая Escherichia coli, золотистый стафилококк, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecium). Однако набор может давать положительные результаты даже после получения чистых посевов крови. Также была разработана панель T2Cauris, позволяющая выявлять C. Auris, которая устойчива к основным классам противогрибковых препаратов. ПЦР-анализ для выявления грибковых нуклеиновых кислот может быть наилучшей диагностической стратегией, поскольку (а) более чувствителен, чем современные культуральные методы, (б) занимает сравнительно меньше времени, чем культуральные тесты, (в) применяется ко многим типам клинических образцов (кровь, жидкости организма, БАЛ, ликвор и т.д.) и (г) применяется для выявления видов, не поддающихся культивированию, или когда культуральные тесты отрицательны из-за раннего начала приема противогрибковых препаратов. Существует множество наборов, например, SeptiFast (Roche Diagnostics, Германия) и MycAssay (Myconostica, Великобритания), для которых не требуется предварительного культивирования грибов и амплификации ДНК, выполняются непосредственно из клинических образцов, что исключает дополнительный этап. SeptiFast m-PCR (Roche Diagnostics, Германия) (мультиплексная ПЦР в реальном времени) использует модифицированный протокол извлечения ДНК, который позволяет с более высокой чувствительностью (90,5%) выявлять патоген всего в 100 мкл крови, что позволяет использовать набор в случаях диагностики грибкового неонатального сепсиса, где получение больших объемов крови от новорожденных и недоношенных является ограничением. Еще одним достижением в области ПЦР является AsperGenius (PathoNostics, Нидерланды), уникальный мультиплексный ПЦР-анализ в режиме реального времени, состоящий из двух мультиплексных ПЦР в режиме реального времени, одна из которых позволяет идентифицировать клинический вид Aspergillus в образце, а вторая мультиплексная - ПЦР для выявления мутации в гене CYP51A A. fumigatus, вызывающей устойчивость к азолам. Таким образом, AsperGenius на самом деле является уникальным подходом, позволяющим одновременно выявлять возбудителя и выявлять наличие лекарственной устойчивости на основе образца BAL пациента. Набор PN-700 MucorGenius Multiplex real-time PCR (25 rxn) (PathoNostics, Нидерланды), нацеленный на Rhizopus spp. Mucor spp. Lichtheimia spp Cunninghamella spp. Rhizomucor spp, может быть использован совместно с AsperGenius для выявления нескольких различных грибов в 1 образце, так как часто наблюдается инфекция мукормикозом на фоне ИА. Оригинальные статьи:
Информация для заказа
|
|
|
© ООО «Лабораторная Диагностика» info@LD.ru тел.: +7 495 369-20-43 |