ООО «Лабораторная Диагностика»
ООО «Лабораторная Диагностика» info@LD.ru    тел.: +7 495 369-20-43
 Главная   Новости   О компании  Каталог продукции и цены   Оформить заказ   Контакты 
 
  
Каталог продукции
  Гематология  
  Гемостаз  
  Иммуногематология  
  Иммуногистохимия
  Иммуноферментный анализ (ИФА)
  Иммунохимия  
  Клеточные технологии  
  Клиническая биохимия
  Коагулометрия  
  Микробиология  
  Мультиплексный анализ  
  Оборудование для биохимии и
  молекулярной биологии
  Общелабораторное оборудование
  Онкология  
  Пищевая промышленность  
  Программное обеспечение  
  Проточная цитометрия
  ПЦР-лаборатория
  Рекомбинантные белки
  Репродуктивные технологии
  Сортировка клеток
  Спектрофотометрия  
  Стволовые клетки (Stem Cells)
  Трансплантология
  Цитогенетическая диагностика
  Экспресс-лаборатория  

 
/ Обзоры и публикации

Окраска по Граму

Немного истории

Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.

Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.

Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.

Грам был скромным человеком и в своей первой публикации отметил, "И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное."         В настоящее время известно много модификаций окраски по Граму.

Теория


Окраска по Граму основана на различиях в строении клеточной стенки прокариот. Грамположительные бактерии имеют толстую, прочную, просто устроенную стенку (толщина более 50 нм)  Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин), построенный их остатком N-ацетил мурамовой кислоты. Прочность линейному полимеру придают поперечные тетрапептидные сшивки, соединяющие отдельные слои пептидогликана. С петидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые или  липотейхоевые кислоты (от греч. teichos - стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола  и рибитола, соединенных фосфатными мостиками.  Молекулы тейхоевых кислот являются рецепторами адгезии (адгезинами), специфическими антигенами многих бактерий.  С пептидогликаном могут быть связаны белки (А, М, Т, R и др.), которые располагаются снаружи также кластерами.  Эти белки являются антифагинами, репелентами фагоцитоза, рецепторами для антител. Смесь S.aureus и E.coli

Грамотрицательные бактерии содержат очень небольшое количество пептидогликана, не имеющего поперечных сшивок. Над слоем муреина располагается периплазматическое пространство, играющее важную роль в обменных процесса (периплазматические ферменты) Далее располагается наружная мембрана, которая имеет строение, характерное для биологических мембран.  Внешний листок наружной мембраны содержит липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, стержневой (базисной) части, или ядра,  и полисахаридной цепи, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями. 

Основной краситель интенсивно связывается муреиновым слоем. Поскольку этот слой у грамотрицательных бактерий очень тонкий и экранируется внешней мембраной, эти микроорганизмы сорбируют значительно меньше красителя, чем грамположительные. 

Йод образует с красителем и муреином сложный комплекс, который труднее вымывается обесцвечивающими растворами. Дифференцирующие растворы вымывают весь краситель из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в то время, как грамположительные еще содержат достаточное количество красителя. 

Дополнительный краситель докрашивает обесцвеченные грамотрицательные бактерии в контрасный цвет.

Варианты окраски

"Классический" метод

Красители и реактивы

  1. Основной краситель
  2. Протравливающий раствор
  3. Обесцвечивающий раствор
  4. Дополнительный краситель

Методика окраски

  1. На фиксированный мазок положить кусочек фильтровальной бумаги и нанести с избытком основной краситель (1-2 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водой, нанести раствор Люголя. (1-2 мин)
  3. Слить раствор Люголя, препарат поместить в спирт (или налить спирт на препарат). (30-60 сек)
  4. Тщательно промыть дистиллированной водой.
  5. Докрасить одним из дополнительных красителей. (1-2 мин)
  6. Промыть и подсушить препарат

 Модификация Hucker

Красители и реактивы 

  1. Основной краситель
  2. Протравливающий раствор
  3. Обесцвечивающий раствор
  4. Дополнительный краситель

Методика окраски

  1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек) 
  3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
  4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить 
  5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
  6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
  7. Промыть и подсушить препарат

 Модификация Burke

Красители и реактивы 

  1. Основной краситель
  2. Протравливающий раствор
  3. Обесцвечивающий раствор
  4. Дополнительный краситель

Методика окраски

  1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
  2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b. (2-3 мин) 
  3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
  4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить)
  5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
  6. Препарат высушить на воздухе.
  7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек)
  8. Промыть и подсушить препарат

 Модификация Kopeloff-Beerman

Красители и реактивы 

  1. Основной краситель
  2. Протравливающий раствор
  3. Обесцвечивающий раствор
  4. Дополнительный краситель

Методика окраски

  1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
  2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более)  
  3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
  4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать
  5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
  6. Препарат высушить на воздухе.
  7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин)
  8. Промыть и подсушить препарат

 Модификация Синева

Красители и реактивы

  1. Основной краситель
  2. Протравливающий раствор
  3. Обесцвечивающий раствор
  4. Дополнительный краситель

Методика окраски

  1. На фиксированный мазок наложить фильтровальную бумагу с основным красителем. Нанести сверху несколько капель воды (1 мин)
  2. Стряхнуть основной краситель. Налить на препарат раствор Люголя. (1 мин)  
  3. Стряхнуть раствор Люголя. Не промывать
  4. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая (или нанести спирт на мазок).
  5. Тщательно промыть дистиллированной водой.
  6. На препарат положить фильтровальную бумагу с дополнительным красителем. Нанести несколько капель воды.(1 мин)
  7. Промыть и подсушить препарат

Модификация Preston-Morrell (требует редакции)

Красители и реактивы

  1. Основной краситель
  2. Протравливающий раствор
  3. Обесцвечивающий раствор
  4. Дополнительный краситель

Методика окраски

  1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)  
  3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
  4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
  5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
  6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
  7. Промыть и подсушить препарат

  

Ошибки

Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

ПричинаРешение

Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)

  1. Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором
  2. Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие
  3. Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску
Старая культура Окраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий - через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста
Культура выращена в неблагоприятных условиях При выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой Культивируйте микроорганизм на полноценной среде
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии) нет

 

Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

ПричинаРешение

Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)

Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении
  1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной \"густотой\" мазка
  2. Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади
  3. При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду

Мазок плохо обесцвечен

  1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием
  2. Повторить приготовление препарата и его окраску
  3. Дообесцветить имеющийся мазок
  4. Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки - заменить раствор.

Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)

нет

   
© ООО «Лабораторная Диагностика»
info@LD.ru   тел.: +7 495 369-20-43