Непрямой метод иммунофлюоресценции

Циркулирующие аутоантитела в сыворотке крови больных выявляют с помощью непрямого метода иммунофлюоресценции, используя различные субстраты из тканей кожи и других органов человека и ряда видов лабораторных животных (крысы, мыши, кролика, обезьяны), т.к. аутоантитела при аутоиммунных буллезных дерматозах направлены к тканеспецифическим антигенам, имеющимся в органах большинства видов животных класса млекопитающих.

При этом различия реакций в титрах на срезах тканей разных видов животных с сыворотками одного и того же больного носит лишь количественный характер. Наиболее чувствительным субстратом по нашим данным являются пищевод кролика, кожа кролика и крысы, слизистая оболочка полости рта крысы; наименее чувствительными - нормальная кожи человека и обезьяны, пищевод обезьяны и нечувствительными - слизистая оболочка полости рта и влагалище обезьяны.

Криостатные нефиксированные срезы толщиной 4-5 мкм тщательно промывают в PBS (pH 7,0-7,4) в течение 10 мин, затем срезы сначала обрабатывают исследуемой (промежуточной) немеченой сывороткой больного. Эту сыворотку применяют в максимально большом числе разведений, учитывая самое большое разведение, которое дает четкую положительную реакцию. Обработку срезов проводят во влажной камере при комнатной температуре в течение 45-60 мин. Далее срезы промывают в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,4), обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов человека класса G и/или A в течение 30 мин, вновь промывают 3-5 мин PBS и заключают под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе.

Одновременно ставят положительный и отрицательный контроли. В качестве отрицательного контроля используют нормальную сыворотку (здорового человека или животного) в тех же разведениях и инкубируют на срезе столько же времени, как и испытуемую сыворотку, содержащую антитела. В качестве положительного контроля используют сыворотку больного, содержащую антитела против изучаемого антигена и хранящуюся в замороженном виде.