Тестирование Т и В клеточных кроссматчей методом проточной цитометрии

по материалам Charles W.Hamrick, Lauralynn K.Lebeck: Flow Cytometric T and B Cell Crosmatching.  

Наличие в сыворотке потенциального реципиента аллотрансплантата специфических антител к HLA-антигенам донора считается противопоказанием к трансплантации. Кроссматч тестирование позволяет выявлять эти предсуществующие анти-донорские антитела в сыворотке реципиента. Использование проточной цитометрии для измерения очень низких концентраций антител в сыворотке пациентов является доказанной клинической необходимостью.

Кроссматч тестирование методом проточной цитометрии (FCXM) проводится путем инкубации донорских клеток и сыворотки реципиента с последующим добавлением флюорохром-конъюгированного анти-человеческого иммуноглобулина. Наиболее широко используется соединенный с флюорохромом FITC поликлональный иммуноглобулин животного происхождения к антигенам человека. Если в сыворотке реципиента присутствуют реактивные антитела к антигенам донора, они свяжутся с донорскими лимфоцитами, затем будут определены при помощи флюоресцентных антител.

Для определения Т-клеточной реактивности добавляются CD3 моноклональные антитела, конъюгированные с флюорохромом. Альтернативно могут добавляться CD19 или CD20 моноклональные антитела для определения наличия В-клеточной реактивности. Рекомендуется применение двухцветного (FL-1 зеленый/ FL-2 оранжевый) или трехцветного (FL-1 зеленый/ FL-2 оранжевый/ FL-3 красный) формата проточной цитометрии для тестирования кроссматч, поскольку многоцветный анализ позволяет элиминировать фоновое связывание при участии натуральных киллеров и моноцитов. В «двухцветном» формате в основном используются CD3 и CD19 конъюгированные с фикоэритрином (PE). В «трехцветном» формате могут быть использованы комбинации CD20 PE и CD3 перидинин хлорофилл протеин (PerCP). Окрашенные клетки фиксируются в растворе формальдегида и анализируются на проточном цитометре.

Результат определяется как позитивный или негативный, основан на 1) отклонении срединного канала интенсивности флюоресценции (MCF, линейные значения) тестируемой сыворотки по сравнению с негативным контролем или аутологичной сывороткой, или на 2) повышении отношения логарифмических значений единиц среднего эквивалентного растворимого флюорохрома (MESF) тестируемой сывортки к негативной контрольной сыворотке.

• Проточный цитометр MACSQuant
• Реагенты для проточной цитометрии

Наименование	Объем	Производство	Метод	Кат.Номер
FACSCalibur. Проточный цитофлюориметр FACSCalibur для клинических лабораторных исследований, биологических и медицинских научных исследований.		BD Diagnostics		342973
Проточный цитометр MACSQuant™ Analyzer 10		Miltenyi Biotec	Проточная цитометрия	130-096-343