ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИТЕЛ

I.M. Bromilow, K.E. Adams, J. Hope, J.A. Eggington, J.K.M. Duquid
Mersey Региональный Трансфузиологический Центр, г. Ливерпуль

Опубликовано в журнале «Transfusion Medicine», 1991, 1-159-161
Опубликовано в журнале «Вестник службы крови России», № 2, апрель 1998, стр. 33-35.

В данной работе мы сообщаем о применении нового метода антенатального скрининга и идентификации антиэритроцитарных антител. Методика была разработана Lapierre (1988, 1990) и теперь является доступной для приобретения. ID-гелевая система представляет собой пластиковые карты с микропробирками, заполненными гелем, к которому добавляются эритроциты или сыворотки. Пробирки с нейтральным гелем содержат модифицированный sephadex с буфером и предназначены для скрининга и идентификации антител с помощью ферментативно обработанных эритроцитов. Гель, содержащий антиглобулиновый реактив, может использоваться для постановки непрямого антиглобулинового теста. Тестирование может выполняться при широком спектре температур. После центрифугирования в специальной центрифуге агглютинированные эритроциты задерживаются в верхних слоях геля, в то время как неагглютинированные эритроциты, беспрепятственно пройдя через гель, образуют осадок на дне пробирок. Таким образом, положительные результаты наглядно отличаются от отрицательных. Положительные результаты могут быть разделены по силе реакции, как и при стандартных методиках.

В настоящей работе 3900 случайно отобранных проб было обследовано на наличие непостоянных антител, параллельно в Mersey Regional Transfusion Center проводились контрольные исследования стандартными методиками. В дальнейшем были протестированы 193 сыворотки, содержащие антитела, специфичность которых была установлена ранее, и которые хранились при температуре -20°С. Титр клинически значимых антител устанавливался параллельно гелевым тестом и стандартными методиками.

Методики скрининга антител

Стандартные методики

Пробы сывороток были протестированы на наличие непостоянных антител четырьмя различными методами: автоматическая полибреновая методика; метод с использованием микротитровальных и U-образных планшетов для проведения непрямого антиглобулинового теста и четырехкратного отмывания; двухэтапная папаиновая методика и непрямой антиглобулиновый тест (НАГТ) в растворе низкой ионной силы (РНИС) в пробирках с использованием 1,5% суспензии эритроцитов в соотношении: два объема клеток и два объема полиспецифического антиглобулинового реактива (Lorne, U.K.). Результаты читались с помощью инверсионного микроскопа и методики "точка и круг". Для тестирования были отобраны эритроциты, гомозиготные по антителам D, c, e, антигены C, E, Fy^А, Jk^А, K и S также были представлены.

Гелевый тест

Гелевая система использовалась в соответствии с инструкциями производителя. Каждая проба одновременно тестировалась РНИС - НАГТ и двухэтапным ферментным (папаиновым) тестом с использованием панели эритроцитов для скрининга, состоящей из трех видов клеток. Для ферментной методики использовались микропробирки с нейтральным гелем, для непрямого антиглобулинового теста - микропробирки, содержащие гель с антиглобулиновым реактивом. В каждую микропробирку добавлялось 50 мкл 0,8% суспензии эритроцитов и 25 мкл сыворотки пациента. После 15 минут инкубации при 37ºС диагностические карты центрифугировались в течение 10 минут при 900 об./мин. Отмывания эритроцитов не требовалось. Если эритроциты задерживались гелем, констатировался положительный результат, если имела место полная седиментация эритроцитов - отрицательный.

Методики идентификации антител

Стандартная методика

Идентификация антител выполнялась с использованием собственной панели эритроцитов из 19 видов клеток и РНИС - НАГТ, как было упомянуто выше для скрининга антител. Такая же панель папаинизированных клеток использовалась для идентификации антител ферментным методом.

Гелевый тест

Использовалась коммерчески производимая панель из 11 видов клеток. Сыворотка тестировалась НАГТ и ферментным тестом, как было описано для скрининга антител. Были также протестированы сыворотки 193 антенатальных пациентов, у которых ранее стандартными методиками были выявлены клинически значимые антитела. Данные пробы хранились при температуре -20ºС. Идентификация (подтверждение) антител и в этом случае выполнялась непрямым антиглобулиновым тестом и ферментным методом как описано выше.

Сыворотки, содержащие идентифицированные клинически значимые антитела, титровались параллельно в РНИС - НАГТ и ферментном тесте стандартным и гелевым методами. В обеих методиках использовались клетки гетерозиготные по соответствующим антигенам. Сила реакции учитывалась по титру.

Результаты

Результаты исследования 3900 отобранных случайным способом сывороток с использованием гелевого теста и стандартных методов представлены в таблице 1. Все анти-Rh антитела, выявленные стандартными методиками, были также выявлены и гелевым тестом. В дополнении к этому, гелевым тестом было выявлено 37 анти-Rh антител, не выявленных или не идентифицированных стандартными методиками (11 анти-D, 1 анти-С, 19 анти-Е, 4 анти-Сw, 2 анти-с). Кроме того, гелевым тестом было дополнительно выявлено 5 клинически значимых антител к антигенам других систем (2 анти-Fy^А, 2 анти-Jk^А, 1 анти-S). Гелевым тестом также был выявлен ряд антител, имеющих меньшее клиническое значение, в том числе анти-Lewis, анти-M, -P₁, -H/I.

Количество выявленных гелевым тестом неспецифических антител (обычно определяемых при помощи папаинизированных эритроцитов) было меньше, чем в случае стандартных методик, равно как и количество ложноположительных результатов. В тех случаях, когда исследовались сыворотки, содержащие идентифицированные ранее антитела, гелевый тест всегда подтверждал полученные ранее результаты. Кроме того, гелевый тест (ферментный метод) выявил также дополнительные антитела в сыворотках двух пациентов. В одной сыворотке, где ранее были выявлены только анти-Е антитела, были обнаружены также анти-с , в другой - найдены анти-С антитела в дополнение к известным ранее анти-D. Некоторые антитела, выявленные как ферментным методом, так и непрямым антиглобулиновым тестом, показывали значительно более сильную реакцию в гелевом тесте и в большинстве случаев определялись в больших титрах, что указывает на более высокую чувствительность гелевого теста. В 31 из 34 случаев гелевый тест выявлял антитела в больших титрах с помощью непрямого антиглобулинового теста. В трех наблюдениях антитела (анти-Е, анти-е и анти-с) не определялись стандартным антиглобулиновым тестом, а с использованием гелевого теста давали титры 17, 9 и 18 соответственно. В трех других наблюдениях (анти-К, анти-S и анти-Fy^А) сравниваемые методики показывали сравнимые титры антител.

Выявление антител гелевым тестом

Заключение

Доказано, что гелевый тест в нашем исполнении является чувствительным методом скрининга и идентификации клинически значимых антител у антенатальных пациентов, часто позволяющим производить диагностику более раннюю, чем стандартные методики. Более высокая чувствительность метода подтверждена его способностью выявлять антитела в более высоких титрах в большинстве случаев. Эта высокая чувствительность может быть обусловлена рядом факторов. В системе используется большее соотношение сывороток и клеток, кроме того постановка непрямого антиглобулинового теста не требует отмывания эритроцитов. Последнее в свою очередь уменьшает возможность удаления с поверхности эритроцитов слабо фиксированных антител, что может иметь место при проведении стандартных методов исследования и приводить к ложноотрицательным результатам. Отсутствие этапа отмывания также способствует уменьшению количества слабоположительных и ложноотрицательных результатов, вызываемых нейтрализацией антиглобулинового реагента следами сыворотки. Кроме того, благодаря отсутствию этапа отмывания исчезает необходимость добавления сенсибилизированных эритроцитов в случае отрицательных результатов с целью проверить эффективность отмывания и активность античеловеческого глобулина, таким образом, уменьшается зависимость результатов от "рук исполнителя".

Гелевый тест с использованием папаинизированных эритроцитов также имел большую чувствительность и меньший процент ложноположительных результатов, чем наши стандартные методики. По результатам данного исследования количество ложноположительных результатов в гелевом тесте было меньше на 38,5%. Количество выявленных неспецифических антител было также меньше. Другими преимуществами гелевого метода являются простота интерпретации и стандартизации результатов, что облегчает обучение персонала. Однако, пользование системой требует навыка и специальных знаний для точной интерпретации результатов. Результаты реакции стабильны в течение нескольких дней, что открывает дополнительные возможности контроля. Наконец, все результаты могут фотографироваться или фотокопироваться для дальнейшего просмотра.

Мы считаем, что гелевый тест является новым, простым и чувствительным методом определения реакции антиген-антитело путем проведения реакции гемагглютинации, имеющим много преимуществ перед стандартными методиками.