Окрашивание микробных клеток

Важнейшее преимущество технологии Chemunex - учет только жизнеспособных клеток независимо от их физиологического статуса и стадии клеточного цикла (учитываются вегетативные клетки, споры, покоящиеся и супрессированные), так как:

1. флюорохромы Chemunex приобретают способность к флюоресценции только под действием эндоферментов клетки
2. накопление данных флюорохромов в клетке возможно только при условии целостности клеточной мембраны

Получаемые результаты наилучшим образом совпадают с результатами чашечного посева.

Варианты окрашивания клеток

Неспецифическое

Окрашиваются все жизнеспособные микробные клетки. Окрашивание обеспечивают: эндоферменты, универсальные для всех микроорганизмов.

Специфическое

Окрашиваются определённые жизнеспособные микробные клетки окрашивание обеспечивают:

• специфические эндоферменты
• специфические ДНК-последовательности
• специфические антитела

Ключевыми этапами выявления и учёта микроорганизмов с использованием флюоресцентных красителей являются окрашивание ими микробных клеток в образце (или мечение) и дальнейшая детекция флюоресцирующих клеток и их подсчёт.

Мечение клеток происходит следующим образом. Первоначально нефлюоресцирующий краситель проникает внутрь клетки, и там под действием клеточных эндоферментов (при условии, что эти ферменты не повреждены, то есть химически активны) переходит во флюоресцирующую форму. В случае, если мембрана клетки сохранила целостность, флюоресцирующая форма красителя накапливается внутри клетки, в результате чего вся клетка обретает способность к флюоресценции. В противном случае флюоресцирующее вещество вытекает из клетки, растворяясь в общем объёме пробы.

Таким образом, условиями успешного флюоресцентного окрашивания являются наличие у клетки активных ферментов и целостной мембраны. Эти же факторы в первую очередь отвечают за жизнеспособность клетки. Применение такого способа окрашивания обеспечивает хорошую сходимость результатов цитометрии от AES Chemunex с данными, полученными традиционными методами. Кроме того, добавление особых "активаторов" ("viability substrates") позволяет эффективно прокрашивать не только метаболически активные, но и покоящиеся клетки. (Подобного результата в технологии мечения клеток и сходимости с данными посевов не достиг ни один из альтернативных производителей флюоцитометров.)

В основе прокрашивания всех без исключения жизнеспособных микробов в образце лежит использование ферментативной реакции, универсальной для всех микроорганизмов. Но наряду с этим существует возможность высокоселективного мечения, в результате которого способность к флюоресенции будут приобретать только микроорганизмы, принадлежащие к какой-либо определённой группе. Такая специфичность обеспечивается либо за счёт особых эндоферментов, присущих только целевой группе микробов, либо за счёт использования специфических для выявляемого микроорганизма последовательностей ДНК, либо антител к клеточной стенке или другим молекулярным структурам.

Примеры окрашивания для разных приложений

Целевой организм:
Все жизнеспособные микроорганизмы (Total Viable Count, TVC)	Плесени и дрожжи	Salmonella spp.	Enterobacteria
Способ мечения:
ферментативный	ферментативный	иммунный	ферментативный после селективного обогащения
Специфичность окрашивания:
универсальное для жизнеспособных микроорганизмов	специфическое для жизнеспособных клеток грибов	специфическое	специфическое для жизнеспособных энтеробактерий